サザンブロッティングのしくみ

サザンブロッティングは、サンプル内の特定のDNA断片を検出するために使用される技術です。

ゲル電気泳動でDNA断片を分離し、フィルター膜に移した後、特定のDNA断片を配列特異的なプローブとハイブリダイズさせ、標識バンドを検出する方法です。

サザンブロッティングでは、試料中の特定のDNAを同定するだけでなく、特定のタイプのDNAのサイズや存在量も決定することができる。

この記事では、サザンブロッティングに関わるプロセスについて説明します。

サザンブロッティングとは

サザンブロッティングは、試料中の特定のDNAを同定するために用いられるハイブリダイゼーション技術です。

この技術は、1975年にEdward M. Southernによって初めて開発されました。

このプロセスにより、サンプル内の特定のDNA配列、サイズ、および存在量が特定される。

図1にサザンブロッティング膜を示す。

：図1 サザンブロッティングメンブレン

サザンブロッティングの応用例

サザンブロッティングの応用例を以下に示す。

1. 特定のDNA断片を検出する
2. 特定のDNA断片を単離する
3. 変異や遺伝子再配列の同定
4. RFLPアッセイ（制限酵素断片長多型）において。
5. 遺伝性疾患を特定する
6. 感染症の特定
7. 父子鑑定
8. 犯罪者の特定を目的としたDNA指紋鑑定において

サザンブロッティングのしくみ

サザンブロッティングは、ゲル電気泳動によりDNA断片をサイズに応じて分離し、メンブレンに転写した後、配列特異的な標識プローブとハイブリダイズさせ、標識バンドを検出する方法です。

サザンブロッティングの手順は以下の通りです。

1. 1. DNA消化 – DNAサンプルを制限酵素で消化してDNA断片を得、この断片をPCRで増幅する。
2. 1. ゲル電気泳動 – ゲル電気泳動により DNA 断片を分画する。
3. 分画したゲルをNaOHまたはHClに浸し、二本鎖DNAを変性させる。
4. ブロッティング – ゲル中の DNA 断片を、正電荷を持つナイロン膜に転写する。
5. ベーキングとブロッキング – DNA断片の入ったブロッティングペーパーをベーキングし、DNAを膜に固定する。その後、ウシ血清アルブミン（BSA）またはカゼインで処理することにより、未占有結合部位を飽和させる。
6. 1. 標識プローブによるハイブリダイゼーション – DNAが結合した膜を、目的のDNA断片に相補的な塩基配列を持つ標識プローブで処理する。ハイブリダイゼーションプローブは一般に100-500bpの長さで、放射性ヌクレオチドで標識されている。
7. 1. オートラジオグラムによる可視化 – プローブが結合した膜をオートラジオグラムで可視化し、目的の DNA 断片のパターンを得る。

図2: サザンブロッティング

サザンブロッティングの全プロセスを図2に示す。

結論

サザンブロッティングは、試料から特定の DNA 配列を同定するために用いられるハイブリダイゼー ション技術です。

このプロセスでは、DNA試料を制限酵素で分画し、その混合物をゲル上で走らせる。

その後、ゲル中のバンディングパターンをナイロン膜に転写し、標識プローブとハイブリダイゼーションさせることで、目的の断片を検出することができる。