DNAシークエンスは、特定のDNA分子の塩基配列を決定するのに役立つ技術です。
シーケンシングの方法には、サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングの2種類があります。
どちらのタイプの配列決定法も、現在まで全自動で行われています。
DNAは、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）という4つのヌクレオチドから構成されています。
DNA断片中のヌクレオチドは、どちらのタイプの配列決定法においても、4つの別々の蛍光マーカーで標識されています。
蛍光マーカー（フルオロフォア）は、光を吸収し、決められた波長で光を放出することができる分子です。
蛍光マーカーは、PCRによってDNA鎖に組み込まれる。
その後、自動化された技術により、ヌクレオチドの配列が決定される。
シーケンスとは
シーケンシングとは、DNA分子の塩基配列を決定するために用いられる実験技術です。
DNAの塩基配列を決定する方法には、大きく分けてサンガーシークエンシングと次世代シークエンシングの2種類があります。
サンガーシークエンシングと次世代シークエンシングは、いずれも蛍光標識したヌクレオチドを使用して塩基配列を決定する。
サンガーシークエンス
サンガーシークエンシングは、DNAの塩基配列を決定する方法として初めて開発されたものです。
1975年にFredric Sangerによって初めて開発された配列決定方法です。
その結果、Sanger sequencingと呼ばれるようになった。
Sanger シークエンシング法は、in vitro DNA 合成の際に、鎖終結ジデオキシヌクレオチド（ddNTPS）を DNA ポリメラーゼに選択的に組み込むことに関与することから、鎖終結法とも呼ばれる。
DNA鎖の伸長は通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）により達成される。
しかし、ddNTPは鎖の伸長を終了させるために反応混合物に添加される。
これらのddNTPは蛍光標識されている。
4種類のddNTPは4つの別々のPCR混合液に添加される。
したがって、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを加えることにより4つの別々のPCR反応が行われる。
各反応混合物では、A、G、C、Tの各ヌクレオチドでそれぞれ鎖伸長を停止させる。
例えば、ddATPを添加した反応混合物では、DNA断片の各Aヌクレオチドで異なるアンプリコンの成長を停止させる。
そして、これら4つの反応をゲル電気泳動で分離し、蛍光光度計で別々の蛍光をスキャンする。
サンガーシークエンスは、DNAクローニングに用いた断片やPCRで増幅した断片の塩基配列を決定するために広く利用されている。
決定された塩基配列を図1に示す。
図1: DNAの塩基配列
次世代シーケンサー
最新のDNA塩基配列決定技術を総称して次世代塩基配列決定と呼んでいる。
チップ上でマイクロスケールで一度に配列決定反応を行うため、複数の配列決定反応を並行して行うことができます。
そのため、複数のシーケンシング反応を並行して行うことができます。
次世代シーケンサーでは、鎖切断法で作られた様々な長さのアムリコンを分離するために、ゲル電気泳動に加え、キャピラリー電気泳動が使用されます。
キャピラリー電気泳動は、電気泳動移動度に基づいて分子を分離する分析分離法です。
塩基配列の決定に役立つ蛍光体メーカーとは？
塩基配列の決定では、塩基配列を決定するDNAを鋳型として、PCRによるDNA合成を行います。
DNAポリメラーゼによるDNA合成の開始には、DNAプライマーが使用される。
PCR反応の成分として、通常の4種類の塩基（dNTP；dATP, dGTP, dCTP, dTTP）と4種類のジデオキシヌクレオチド（ddNTP；ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP）のうち低レベルの混合物が添加される。
したがって、4つのddNTPをそれぞれ添加することにより、4つの個別のPCR反応が行われる。
ジデオキシヌクレオチドには2つの特徴があります。
- 1）DNAポリメラーゼによって付加される3′-OH基を持たない。したがって、ddNTPの取り込みは鎖の成長を終了させる。
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- ddATPは緑色、ddGTPは黄色、ddCTPは青色、ddTTPは赤色の蛍光色素で標識されており、蛍光色素の種類によって鎖の伸長が異なる。
しかし、鎖を終結させるddNTPは低濃度で添加されており、PCRプロセス全体を一度に終結させることはない。
しかし、4つのddNTPのうちの1つが成長している鎖に取り込まれると、その特定の鎖の成長が終了する。
したがって、4回のPCR反応の最後に、一連のアンプリコン（PCRによって得られるDNA断片）が生成され、それらは標的DNA断片の各ヌクレオチドで終止する。
これらのアンプリコンをゲル中で走らせることができる。
電気泳動ゲルの規定点を通過した蛍光色素は、自動DNAシーケンサーで塩基配列を決定するために蛍光光度計でスキャンされることができる。
図2に、DNAシーケンサで得られる蛍光標識塩基配列の様子を示す。
図2：蛍光標識ヌクレオチド塩基配列
一連のヌクレオチドを組み合わせることで、最初のDNA断片のヌクレオチド配列が決定されます。
750～1,000塩基対の断片であれば、サンガーシークエンスにより1回で容易に塩基配列を決定することができる。
しかし、全ゲノムの塩基配列決定には、大量の塩基が存在するため、まだ課題が残されている。
454は次世代シーケンサーの一種で、1回の操作で2,000万塩基対を読み取ることができる。
結論
シーケンシングとは、特定のDNA断片の塩基配列を決定するために使用される技術です。
サンガーシークエンスと次世代シークエンスが主なシークエンス技術です。
どちらの技術も、塩基配列の決定に蛍光マーカーを使用する。
4つの鎖終結ジデオキシヌクレオチドをそれぞれ4種類の蛍光色素で標識し、それらを4回の別々のPCR反応に用いて塩基配列を得る。
