主な違い – PCR vs RT-PCR
PCRとRT-PCRは、分子生物学において重要な技術です。
PCRは1980年代にKary Mullisによって開発された。
特定の遺伝子のコピー数を指数関数的に増加させることができ、特定のDNA断片の検出を容易にすることができます。
Taq Polymeraseは、PCRシステムで最も頻繁に使用される酵素です。
これは耐熱性の酵素です。
RT-PCRでは、逆転写の後にPCRが行われる。
逆転写酵素はRNAから相補的なDNAの合成に関与する酵素です。
PCRとRT-PCRの主な違いは、PCRが二本鎖DNAを鋳型として使用するのに対し、RT-PCRはRNAを鋳型として使用する点です。
PCRとは
PCR (Polymerase Chain Reaction) は比較的単純な方法であるが、画期的な方法です。
PCRは、DNAポリメラーゼという酵素が、提供された鋳型鎖に相補的に新しいDNA鎖を合成する能力を利用する。
遺伝子の機能解析、遺伝性疾患の診断・監視、DNAクローニング、塩基配列決定、古代のDNA増幅など、臨床・研究機関において欠くことのできない技術です。
鋳型、ヌクレオチド、プライマー、DNAポリメラーゼがPCRの4大要素です。
鋳型は、通常、増幅したい標的配列を持つ二本鎖DNAです。
PCRにはThermus aquaticsから単離されたTaq DNAポリメラーゼがよく使われる。
また、Pfu DNAポリメラーゼも高忠実度のDNAポリメラーゼの一種である。
TaqもPfuも耐熱性のあるポリメラーゼです。
DNAポリメラーゼが付加するヌクレオチドは、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）です。
DNAポリメラーゼは既存のDNA鎖の3′末端にしか新しいヌクレオチドを付加できないので、DNA合成の開始にはオリゴヌクレオチドのプライマーが必要である。
PCRではプライマーが必要なため、鋳型の中の特定の領域のみを画定することができる。
標的配列はフォワードプライマーとリバースプライマーによって挟まれる。
PCRの最後には、特定のDNA配列のアンプリコンと呼ばれる新しいコピーが数十億個蓄積される。
PCRの構成要素は、失敗を最小限に抑えながらPCRのパフォーマンスを向上させるように最適化されている必要がある。
PCRは、異なる温度を切り替えることができるサーマルサイクラーによって行われる自動化されたプロセスです。
PCRは3つのステップで行われる。
- 変性 – 二本鎖DNA鋳型を94-95℃に加熱し、二本の一本鎖に分離する。
- アニーリング – フォワードおよびリバースプライマーが鋳型内の相補的な配列に結合する。この段階の温度は、プライマーの組み合わせの融点に依存する。
-
- プライマー伸長 – DNAポリメラーゼ酵素が、伸長中の鎖に相補的な塩基を付加して、各プライマーの3’末端を伸長させる。伸長ステップの温度は、Taqポリメラーゼの至適温度である72℃が用いられる。伸長時間は、鋳型鎖の塩基対の数に依存する。
この3つのステップを28-35回繰り返す。
PCRの産物は、アガロースゲル電気泳動により、DNAラダーと比較してサイズ分画される。
アガロースゲル上のDNAの可視化は、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下で観察することにより行う。
図2に、エチジウムブロマイドで染色したゲルのUV下での増幅DNAバンドを示す。
DNAラダーは一番左のウェルに表示されている。
図2: DNAバンド
RT-PCRとは
RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) は、mRNA を検出するための最も感度の高い技術の一つです。
RNAは、正常な組織の遺伝子発現や感染組織の遺伝子発現の情報を収集するのに適した鋳型です。
RT-PCRの鋳型には、トータルRNA、ウイルスRNA、バクテリアRNAのいずれかを用いることができる。
RNA は逆転写酵素により相補的 DNA (cDNA) に逆転写される。
逆転写酵素の至適温度は46℃です。
このcDNAを用いてPCRを行い、産物を得る。
図3に逆転写PCRのステップを示す。
図3: 逆転写PCRの手順
RT-PCRは2段階反応と1段階反応があります。
2ステップ反応では、逆転写とPCRを2つのステップで行う。
ワンステップPCRでは、逆転写の後にPCRを1本のチューブで順次行います。
cDNAとPCR産物は、アガロースゲルで分画し、可視化することができる。
図4は、1ステップおよび2ステップのRT-PCRを示したものです。
図4: 一段階および二段階 RT-PCR
PCR と RT-PCR の違い
定義
PCR。
PCRは分子生物学において、DNAの断片を増幅し、何百万ものDNA配列のコピーを生成するために使用される技術です。
RT-PCR。
RT-PCRは、分子生物学における遺伝子発現の検出に使用されるPCRの一種である。
ステップ数
PCRを行う。
変性、アニーリング、伸長の3つのステップで構成される。
RT-PCR: RT-PCRでは、逆転写の後、PCRを行う。
テンプレート
PCRのこと。
二本鎖DNA分子がPCRの鋳型となる。
RT-PCR。
一本鎖のRNA分子が逆転写の鋳型となる。
一本鎖のDNA分子がPCRの鋳型となる。
使用した酵素
PCRを行う。
PCRの酵素としてDNAポリメラーゼを使用します。
RT-PCR。
RT-PCRでは、逆転写酵素とDNAポリメラーゼが酵素として使用されます。
プライマー
PCRを行う。
PCRでは、ForwardとReverseのプライマーを使用します。
RT-PCR: 逆転写にはリバースプライマーのみを使用し、PCRにはフォワードプライマーとリバースプライマーの両方を使用します。
感度
PCR。
PCRは感度の高い方法です。
RT-PCR法。
RT-PCR法は、PCR法よりも感度が高い。
アプリケーション
PCR 遺伝子の機能解析、遺伝性疾患の診断とモニタリング、DNAクローニング、DNAシークエンス、古代DNAの増幅などに使用される。
RT-PCR。
遺伝子の発現を検出するために使用される。
結論
PCR と RT-PCR は分子生物学で使用される重要な技術です。
PCR と RT-PCR は共に、フォワードプライマーとリバースプライマーで定義された標的 DNA 配列のコピー数を指数関数的に増加させることができる自動化技術です。
PCRでは、二本鎖DNAが鋳型として使用される。
PCRにより、DNAクローニング、DNA塩基配列の決定、遺伝子の機能解析が可能である。
一方、RT-PCR では、RNA を増幅することで、特定の組織での遺伝子発現を観察することができる。
PCRとRT-PCRの主な違いは、それぞれの反応に用いる鋳型とその用途です。
- “Polymerase Chain Reaction (PCR)”. ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション。U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. ここで利用可能。2017年6月1日付。
- “Polymerase Chain Reaction (or PCR)”. 遺伝子のクローニングと分子生物学的解析. N.p., n.d. Web. ここで利用可能。2017年6月1日付。
- Biolabs, New England. “CDNA Synthesis & RT-PCR”. CDNA Synthesis & RT-PCR｜NEB. N.p., n.d. Web. ここで入手可能。2017年6月01日（木）です。
- “ポリメラーゼ連鎖反応” By Enzoklop – Own work (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
- “DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis.” By Rainis Venta – 自作 (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
- “逆転写ポリメラーゼ連鎖反応” By Jpark623 – 自作自演 (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
- このような場合、「1段階対2段階RT-PCR」 By Jpark623 – 自作自演 (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
