シーケンシングとは、特定のDNA断片のヌクレオチド配列の決定に関与するプロセスのことである。
塩基配列決定では、DNA断片をPCRにより蛍光標識したヌクレオチドで末端を標識する。
この工程では4種類の蛍光標識ヌクレオチドが用いられるが、それらはジデオキシヌクレオチド（ddNTP）です。
ddNTPには、入力するヌクレオチドのリン酸基が結合する3′OH基がないため、ddNTPが入力されると、そのリン酸基が結合する。
したがって、ddNTPが成長している鎖に加えられると、鎖の3′末端ではそれ以上ヌクレオチドが付加されることはありません。
つまり、成長している鎖にddNTPが加わると、鎖の成長が終了する。
ddNTPは低濃度でPCR混合液に添加されるため、それぞれの成長する鎖は異なるレベルで終止する。
発光している蛍光を検出することで、PCR終了時のDNA断片の塩基配列を決定することができる。
DNA シークエンスとは
DNA シークエンスは、特定の DNA 分子の塩基配列を決定するために使用される実験技術です。
蛍光標識されたヌクレオチドを使用し、PCRの際に取り込まれる。
蛍光を検出する技術により、主に2つの方法があります。
サンガーシークエンスと次世代シークエンスです。
サンガーシークエンス
サンガーシークエンシングは、1975年にFredric Sangerによって開発された最初のシークエンシング方法です。
In vitroでのDNA合成時に鎖終結ddNTPを選択的に取り込むことから、鎖終結法とも呼ばれる。
サンガーシークエンシングでは、アンプリコンをゲル電気泳動で分離する。
サンガーシークエンスは、クローニングに用いたDNA断片やPCRで増幅した断片の塩基配列を決定するために広く利用されている。
図1に決定したDNA配列の一例を示す。
図1: DNA塩基配列の決定方法
次世代シーケンサー
最近のDNAシーケンシング技術の多くは、次世代シーケンシングと総称される。
また、鎖切断法とも呼ばれる。
次世代シーケンサーは、鎖切断法で作られた様々な長さのアンプリコンをキャピラリー電気泳動で分離する。
ゲノム解読など、1回に大量の塩基配列を決定する場合に使用される。
DNA配列決定のしくみ
DNA塩基配列の決定では、蛍光標識されたヌクレオチドがPCRによって特定のDNA断片に付加される。
DNA鎖の伸長には、通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）が使用される。
しかし、反応混合物には蛍光標識されたddNTPが添加される。
ddNTPはデオキシリボース糖分子に3′OH基を持たないため、それ以上の鎖伸長が起こらず、鎖伸長を終了させることができる。
DNAの糖-リン酸骨格は、デオキシリボース糖の3′OH基と入力されたヌクレオチドのリン酸基との間でホスホジエステル結合が形成されることにより形成されている。
しかし、ddNTPは低濃度で添加されるため、一度に鎖の伸長を終了させることはない。
4種類のddNTPが4つの別々のPCR混合物に添加される。
ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを加えて4回の別々のPCR反応を行う。
したがって、各反応混合物において、鎖の成長はそれぞれA、G、C、およびTのヌクレオチドで終結される。
例えば、ddATPを添加した反応混合物では、DNA断片中の各Aヌクレオチドで異なるアンプリコンの成長が停止する。
サンガーシークエンスによるDNA配列の決定を図2に示す。
図2: サンガーシークエンス
ddATPは緑色、ddGTPは黄色、ddCTPは青色、ddTTPは赤色と、4種類のヌクレオチドがそれぞれ別の蛍光色素で標識されている。
したがって、4つのPCR反応のアンプリコンは別々の色で標識されている。
目的のDNA断片を増幅した後、アンプリコンはゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動で分離される。
増幅されたDNA断片の塩基配列は、発光する蛍光を検出することにより決定することができる。
750～1,000塩基対の長さの断片は、サンガーシークエンスにより1回で容易に塩基配列を決定することができる。
しかし、ゲノムに含まれる塩基の数が多いため、ゲノム全体の塩基配列を決定することは依然として困難です。
しかし、454シーケンサーのような次世代シーケンサーでは、1回で約2,000万塩基対を読み取ることができる。
結論
DNA シークエンシングは、DNA 断片の塩基配列を決定するために使用される分子生物学的手法です。
塩基配列決定では、蛍光標識したヌクレオチドをPCRでDNA断片に付加する。
蛍光を発するヌクレオチドを検出することで、塩基配列が決定される。
