部位特異的変異誘発法（SDM）は、既知の配列に変異を生じさせるin vitroの方法です。
PCRを用いた手法で行われることが多い。
通常、部位特異的変異導入法では、1つまたは2つの塩基が変更される。
塩基配列にわずかな変化を導入するために、所望の変異を持つプライマーを設計することができる。
大規模な変異を導入するためには、プライマー伸長と逆PCRを用いることができる。
この方法では、特定のタンパク質のアミノ酸組成を変更することができる。
部位特異的変異導入法は、タンパク質の活性の変化を研究するために使用される。
また、融合タンパク質の作成にも同様に使用されます。
サイト・ダイレクト・ミュータジェネシスとは？
部位特異的変異導入法とは、遺伝子の塩基配列に特定の変化を導入するために用いられる分子生物学的手法です。
タンパク質のアミノ酸配列の変更、制限部位の導入・除去、転写結合部位の破壊、融合タンパク質の作成などに利用される。
プロセス
部位特異的変異導入法では、目的の変異を含むプライマーを用いて、プラスミドに変異を導入する。
鋳型全体がPCRによって増幅され、鋳型に変異が組み込まれる。
その後、メチル化依存性エンドヌクレアーゼという酵素を用いて、親鋳型を試料から除去する。
PCR産物または所望の変異を有するニック付きプラスミド分子は、バクテリアに形質転換される。
所望の改変を施したプラスミドをバクテリアから単離することができる。
部位特異的変異導入法のプロセスを図1に示す。
図1: 部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis
部位特異的変異導入法では、主に3種類の方法を用いて目的の変異を導入する。
それらは伝統的なPCR、プライマー伸長法、inverse PCRです。
プライマー伸長法と逆PCR法は、大規模な塩基変化を導入することができる。
従来のPCR
Traditional PCRは、改変したプライマーを用いてターゲット配列に1つまたは2つのヌクレオチド変化を導入するために使用することができます。
その変化はヌクレオチドの置換、欠失、または付加であることができる。
変異はPCR中にアンプリコンに組み込まれる。
従って、プライマー中の元の配列は変異した配列に置き換えられる。
プライマーエクステンション
プライマーエクステンションでは、nested PCRの際に目的の変異を組み入れる。
ここでは、標的配列は2つのプライマーで挟まれる。
目的の変異は内部プライマーに組み込まれ、2回目のPCRで変異が導入される。
一般に、PCR反応の特異性はプライマー中のミスマッチ塩基の数が増加するにつれて低下する。
しかし、大規模な変異を持つ長い内部プライマーを用いてプライマー伸長を行うことで、nested PCRによるPCR反応の特異性を高めることができる。
インバースPCR
Inverse PCR は既知の DNA 配列にプライマーを設計し、未知の DNA 断片を増幅する方法です。
大規模な塩基の置換、削除、挿入を行うことができる。
以下に部位特異的変異導入法の応用例を示す。
- タンパク質の構造、機能、触媒作用の研究
- タンパク質の特性を改良する（タンパク質工学）。
- 制限酵素の導入や除去を行う。
部位特異的突然変異誘発のためのプライマー設計法
部位特異的変異導入法とは、プライマーを用いて目的の変異を導入する方法です。
変異は置換、挿入、欠失のいずれでも可能である。
プライマー中の塩基の不一致が多くなるとPCRの特異性が低下するため、従来のPCRでは標的配列に1〜2塩基対の変化しか導入することができなかった。
大規模な変異を導入するためには、プライマー伸長法や逆PCR法などの他の方法を用いることができる。
部位特異的変異導入法におけるプライマー設計を図2に示す。
図2: サイトディレクテッドミュータジェネシス用プライマー
代用品
置換の場合、2つのプライマーのうち1つは、プライマーの途中に目的の変異を含む必要がある。
ここで、変異を含む部位は歪みを形成しているため、標的配列とアニールしない。
削除
Deletionの場合、ターゲットから削除される配列はプライマー設計の際に無視することができる。
この配列はプライマーで囲まれた領域から離れた場所にあるため、PCRで増幅されることはない。
挿入
挿入の場合、プライマー設計時に追加する配列がいずれかのプライマーの5’末端に絡んでしまう。
そのため、挿入された配列がアンプリコンに付着したままとなる場合があります。
結論
部位特異的変異導入法は、DNA配列に変異を導入するために使用される技術です。
これらの変異は置換、挿入、または欠失です。
小規模な変異は従来のPCRで導入することができる。
大規模な変異はプライマー伸長法またはinverse PCRで導入することができる。
変異の導入はプライマーに目的の変異を組み込むことで行われる。
