ウェスタンブロッティングのしくみ

ウェスタンブロッティングは、分子生物学において、試料中の特定のタンパク質を検出するために使用される技術です。

SDS-PAGEを用いて、タンパク質をサイズに基づいて分離し、分離したタンパク質を膜に転写する。

この手法では、ブロット内の特定のタンパク質を標識するために、特定の一次抗体を使用します。

レポータータンパク質で標識された二次抗体は、一次抗体で標識されたタンパク質を検出する。

ウェスタンブロッティングとは

ウェスタンブロッティングは、試料中の特定のタンパク質を検出するために使用されるハイブリダイゼーション技術です。

また、抗体を用いて目的タンパク質を標識し、標識タンパク質を検出することから、イムノブロット法とも呼ばれています。

図1: ウェスタンブロット

ウェスタンブロッティングは1979年にTowbinによって開発され、現在ではタンパク質解析のルーチン技術として用いられている。

ウェスタンブロッティングのしくみ

ウェスタンブロッティングは、主にサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用されます。

以下に、ウェスタンブロッティングの手順を説明します。

1. 1. SDS-PAGE – タンパク質サンプルは、SDS-PAGEによってサイズに基づいて分離されます。
2. 1. 膜へのタンパク質の転写 – 分画されたタンパク質は、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写されます。この際、拡散転写が行われる。
3. 1. 非特異的部位のブロック – タンパク質の非特異的結合を防ぐために、膜上の未占有部位をブロックする。脱脂粉乳やウシ血清アルブミン（BSA）などを使用することができます。
4. 1. 一次抗体のインキュベーション – ブロックしたメンブレンを一次抗体溶液とインキュベートする。これらの一次抗体は、メンブレン上の特定のタンパク質に結合します。
5. 二次抗体のインキュベーション – 一次抗体と結合する二次抗体とメンブレンをインキュベートします。二次抗体はレポータータンパク質と結合しています。このレポータータンパク質は、ビオチン、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどです。
6. 1. 発色によるタンパク質検出-結合した酵素レポーターが基質と反応して発色する。アルカリホスファターゼは BCIP を青色に変換し、西洋わさびペルオキシダーゼはルミノールを変換してルミノールを発色させる。

図2：ウェスタンブロッティング – 手順

結論

ウェスタンブロッティングは、試料中の特定のタンパク質の存在を検出するために使用されるハイブリダイゼーション技術です。

SDS-PAGEを用いて、タンパク質をそのサイズに基づいて分離し、一次抗体と結合させ、発色中に二次抗体によって認識させることができる。