マキサムギルバートシーケンスとサンガーシーケンスの大きな違いは、マキサムギルバートシーケンスは、DNAを核酸塩基特異的に部分化学修飾し、その後、修飾した核酸に隣接する部位でDNAバックボーンを切断することによる化学的手法である点です。
一方、サンガーシーケンスは、ジデオキシヌクレオチドを配列に組み込むことでDNA配列の伸長を中断させる鎖終結法です。
さらに、マキサムギルバートシーケンスでは、放射性物質やヒドラジンなどの有害な化学物質を大量に使用します。
また、Maxam Gilbert法では放射性物質やヒドラジンなどの危険な薬品を大量に使用しますが、Sanger法では危険な薬品は使用しません。
マキサムギルバート法とサンガー法は、1970年代半ばに開発された従来のDNA塩基配列決定法です。
一般的には、DNA分子内の塩基を決定する役割を担っている。
主な対象分野
- Maxam Gilbert Sequencingとは？
– 定義、プロセス、重要性 - サンガーシークエンシングとは
– 定義、プロセス、重要性 - Maxam GilbertとSanger Sequencingの類似点とは？
– 共通点の概要 - Maxam GilbertとSanger Sequencingの違いとは？
– 主な違いの比較
この記事の重要な単語
従来法、DNAシーケンス、マキサムギルバートシーケンス、サンガーシーケンス
マキサムギルバートシークエンスとは
Maxam Gilbert シークエンシングは、1977年から1980年にかけてAllan MaxamとWalter Gilbertによって開発された従来の2つのDNA シークエンシング法のうちの1つです。
また、DNAシーケンシングの化学的手法としても知られている。
概要
基本的には、DNA分子を化学物質で末端標識した後、4種類の化学反応によりDNAの塩基を修飾する方法です。
その後、DNAは修飾されたA+G、G、C+T、Cの塩基の付着する箇所で切断される。
その後、標識された末端から塩基の位置まで放射性断片が合成される。
最後にPAGEで切断点を分離し、DNAの4塩基それぞれについて4種類の切断パターンを生成する。
化学
Maxam Gilbert Sequencingの手順は以下の通りです。
- γ-32P ATPを用いたキナーゼ反応による5′末端への放射性標識と精製。
- A+G、G、C+T、C塩基の4つの化学処理（ギ酸によるプリン（A+G）の脱プリン、ジメチル硫酸によるグアニン（G）のメチル化、ヒドラジンによるピリミジン（C+T）の加水分解、塩化ナトリウム添加によるチミンのヒドラジン反応阻害、シトシン（C）だけを加水分解） 3.
- ホットピペリジンによる修飾DNAの切断；(CH2)5NHが修飾塩基の位置で、放射性標識末端から最初の「切断」部位まで一連の標識断片を生成する。
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- ポリアクリルアミドゲル電気泳動で断片のサイズ分画を行う。
- 5.オートラジオグラフィーによる可視化、配列の推定 図1: Maxam Gilbert Sequencing
重要性
基本的に、Maxam Gilbertのシーケンシングの大きな特徴は、感度と特異性の両方が高いということである。
そのため、塩基間の区別をしっかりと行うことができる。
しかし、200-300塩基の塩基配列を解析するのに数日かかる。
一方、放射性元素と神経毒であるヒドラジンの両方を使用する。
サンガーシークエンスとは
サンガーシークエンシングは、1977年にFrederick Sangerらによって開発された従来のDNA配列決定法の2番目の方法です。
アプライドバイオシステムズ社によって製品化されたことが大きな特徴です。
概要
一般にサンガーシークエンスは、DNAポリメラーゼによるin vitroのDNA複製で鎖終結ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を取り込むことに基づく鎖終結法とも呼ばれる。
ddNTPは、入力するヌクレオチドとホスホジエステル結合を形成するための3′-OH基を持たないため、DNAポリメラーゼは修飾ddNTPの組み込みによってDNAの伸長を停止させるという重要な特徴があります。
また、これらのddNTPは放射能または蛍光で標識されているため、塩基を検出することができる。
化学
サンガーシークエンスの手順は、以下の通りです。
- DNAサンプルをddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTPの4つのシーケンス反応に分けます。
- 蛍光標識（ddATP：緑色色素、ddCTP：青色色素、ddGTP：黄色色素、ddTTP：赤色色素）。
- 対応するddNTPを用いた別々のPCR反応の実施。このとき、ジデオキシヌクレオチド濃度は対応するデオキシヌクレオチドの約100倍低くする必要があります。
- 4.熱変性と変性ポリアクリルアミド-尿素ゲルでのアンプリコンの分離。4つの反応を4つの個別レーン（レーンA、T、G、C）のいずれかに実行する。
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- 可視化およびDNA配列の決定 図2: サンガーシークエンシング
重要性
サンガーシークエンスは、DNAの塩基配列決定を大幅に簡略化した方法です。
そのため、この方法の登場により、様々な遺伝子や生物の塩基配列データをより迅速に蓄積することが可能となり、DNAシーケンスの発展に拍車をかけた。
しかし、この方法では、危険な化学物質をあまり使用しません。
しかし、サンガー法の感度は比較的低い。
マキサムギルバートとサンガーシークエンスの類似性
- マキサムギルバート法とサンガー法は、従来のDNA塩基配列決定法です。
- また、第一世代シーケンサーの手法です。
- 自動塩基配列決定と比較すると、時間がかかり面倒です。
- また、500塩基までの短いDNA断片を解析することが可能です。
- ただし、DNA断片の両鎖の配列決定が可能です。
- 一般に、このような原理で次世代シーケンサーが開発されました。
マキサムギルバートとサンガーシークエンスの違い
定義
マキサムギルバートシーケンスとは、ヌクレオチドに特異的な部分化学修飾とそれに続くDNA切断に基づくDNA配列決定法を指す。
これに対し、サンガーシークエンシングは、in vitroのDNA複製の際に、DNAポリメラーゼが鎖終結ジデオキシヌクレオチドを選択的に取り込む過程を指す。
開発元
Maxam Gilbert sequencingは1977年から1980年にかけてAllan MaxamとWalter Gilbertによって、Sanger sequencingは1977年にFrederick Sangerらによって開発されたものです。
として知られています。
マキサムギルバートシーケンスは化学的手法で、サンガーシーケンスは鎖切断手法で配列決定される。
化学物質
Maxam Gilbertシーケンシングは放射性物質やヒドラジンなどの危険な化学物質を大量に使用しますが、Sangerシーケンシングは危険性の低い化学物質を使用します。
感度および特異度
Maxam Gilbertシークエンスは高感度、高特異度で、Sangerシークエンスは低感度、低特異度です。
結論
Maxam Gilbert シークエンスは、従来の2つの DNA シークエンス法のうちの1つです。
一般に、DNA鎖上の塩基を特異的に修飾するために様々な化学物質を使用する。
最終的には、修飾された部位でDNAが切断されることにより、塩基を特定することができる。
この方法は、感度と特異性が高いのが特徴です。
しかし、危険な化学物質を使用する。
一方、サンガーシーケンスは、従来のDNA配列決定の第二の方法であり、広く利用されている。
通常、標識されたddNTPを使用して、DNA複製中に伸長した鎖を4つのヌクレオチドのそれぞれで終止させます。
最後に、終止したアンプリコンをゲル上で分離することで、DNA配列を決定することができる。
しかし、この方法は、最初の方法と比較して、特異性や感度が劣る。
それでも、危険な化学物質を使うことは少ない。
したがって、Maxam GilbertとSanger sequencingの主な違いは、その方法と重要性です。
