DNAシークエンスは、特定のDNA断片の塩基配列を決定するために使用される技術です。
サンガーシークエンシングと次世代シークエンシングの2種類があります。
蛍光マーカーは、塩基配列の各塩基を識別するために使用されます。
蛍光マーカーのDNA断片への組み込みには、PCRが用いられる。
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は、実験室で特定のDNA断片のコピーを数百万個作るために使用される技術です。
ゲル中のPCR断片を分析することで、DNA断片のヌクレオチド配列を決定することができる。
シーケンスとは
シーケンシングとは、DNA分子の塩基配列を決定するために用いられる実験技術です。
サンガーシークエンスと次世代シークエンスが、DNA塩基配列決定の主な方法です。
どちらの方法も、PCRによってDNA鎖に蛍光物質を組み込むことで、特定のDNA鎖の塩基配列を決定するものです。
サンガーシークエンス
サンガーシーケンスと呼ばれる配列決定方法は、1975年にFredric Sangerによって初めて開発されたものです。
その結果、サンガーシークエンシングと呼ばれるようになった。
サンガーシークエンシングは、in vitroのDNA合成の際に、鎖終結ジデオキシヌクレオチド（ddNTPS）をDNAポリメラーゼが選択的に取り込むことに関与しています。
そのため、鎖終結法とも呼ばれています。
通常のデオキシヌクレオチド(dNTP)はDNA鎖の伸長に使用されるが、ddNTPは鎖の伸長を終了させるために反応混合物に添加される。
4種類のddNTPは4つの別々のPCR混合液に添加される。
したがって、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを添加することにより、4つの別々のPCR反応が行われる。
それぞれの反応混合物について、添加したddNTPを1種類（ddATPを添加した場合）、異なるアンプリコンの成長をDNA断片の各（A）ヌクレオチドで終止させる。
その後、4つの反応物をゲル電気泳動で分離する。
発光する蛍光は蛍光光度計で検出される。
サンガーシークエンスは、DNAクローニングに用いた断片やPCRで増幅した断片の塩基配列を決定するために広く利用されている。
サンガーシークエンシングの一般的な手順を図1に示す。
：図1 サンガーシークエンスの一般的な流れ
次世代シークエンス
次世代シーケンサーとは、最新のDNAシーケンサー技術の総称です。
次世代シーケンサーでは、チップ上で複数の配列決定反応を一度にマイクロスケールで行う。
いずれの塩基配列決定法も、蛍光を持つ標識ヌクレオチドをPCRの際にアンプリコンに取り込み、塩基配列を決定することができる。
次世代シーケンサーでは、蛍光マーカーの連鎖付加も関与している。
しかし、サンガーシーケンサーと次世代シーケンサーの大きな違いは、次世代シーケンサーでは異なる標識のアンプリコンを分離するためにキャピラリー電気泳動が用いられることである。
キャピラリー電気泳動は、分子の電気泳動移動度に基づいて分離する分析分離法です。
DNA塩基配列の解読にPCRが使われる理由
塩基配列の決定では、蛍光マーカーをDNA鎖に組み込んで塩基配列を決定する必要がある。
この組み入れはPCRで行われる。
一般に、PCRでは4種類のdNTPが新たに合成されたDNA鎖に取り込まれる。
この現象を利用して、DNA配列決定では、蛍光標識したジデオキシヌクレオチド（ddNTP）をアンプリコンに取り込みながら、DNA配列を決定していく。
一般に、DNA塩基配列決定の際には、PCR反応混合物に通常の4塩基（dNTP；dATP, dGTP, dCTP, dTTP）の混合物を添加する。
また、4種類のジデオキシヌクレオチド（ddNTPs；ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP）のうち1種類はPCR反応の成分として低濃度で添加される。
最終的に4回のPCR反応を行い、全塩基配列を決定する。
図1：決定されたDNA配列
ddNTPは3′-OH基を持たないため、DNAポリメラーゼはこの基にヌクレオチドを付加する。
したがって、ddNTPの取り込みによって鎖の成長が終了する。
このように、4つのPCR反応のそれぞれで、鎖の終結は特定の塩基で起こる。
また、これらのddNTPには異なる蛍光色素が組み込まれている（ddATPは緑、ddGTPは黄、ddCTPは青、ddTTPは赤の色素で標識されている）。
蛍光色素の取り込みと鎖の切断はPCR中に行われる。
アンプリコンをゲル上で走らせ、自動シーケンサの蛍光光度計でゲルの蛍光をスキャンし、塩基配列を決定する。
結論
DNA シークエンシングは、特定の DNA 断片の塩基配列を決定するために使用される実験技法です。
サンガーシークエンスと次世代シークエンスは、PCRの際にDNA断片に異なる蛍光色素を組み込み、塩基配列を決定する。
