主な違い – プローブとプライマー
PCRとは、バイオテクノロジーにおいて、特定のDNA断片を増幅し、様々な用途に用いる技術です。
プローブとプライマーは、様々なタイプのPCRで使用される一本鎖のオリゴヌクレオチドの2つのタイプです。
プローブは主にqPCRで使用され、合成プライマーはあらゆるタイプのPCRで使用される。
プローブとプライマーの主な違いは、プローブが二本鎖DNAとのハイブリダイゼーションにより混合物中の特定のDNA断片の存在を検出するのに用いられるのに対し、プライマーは一本鎖DNAとのハイブリダイゼーションによりポリメラーゼ連鎖反応を開始するのに使用されることである。
一般に、プライマーは細胞内でDNAの複製を開始する際に使用される。
プローブは、ハイブリダイゼーション反応にも使用される。
プローブとは
プローブとは、試料中の特定のDNA断片の存在を検出するために使用されるDNAまたはRNAの断片です。
したがって、プローブはqPCRとハイブリダイゼーション反応の2種類の技術に使用することができる。
プローブを設計する際には、4つの事実を考慮する必要がある。
- 位置 – プローブはリバースプライマーまたはフォワードプライマーに近接したDNA鎖とハイブリダイズする必要があります。しかし、プライマーの結合部位と重なってはならない。一般に、プローブはDNA二重鎖のどちらかの鎖とハイブリダイズする。
- 融解温度（Tm）-プローブの融解温度は、プライマーの融解温度より6〜8℃高いことが必要です。
- アニーリング温度 (Ta) – 実験のアニーリング温度は、プライマーの融解温度より5 ℃低いことが望ましい。
- GC content – プローブのGC contentは35-65%であることが望ましい。プローブの5′末端にはGが含まれていないことが望ましい。
qPCRでは、プローブは蛍光色素や放射性元素で標識されている。
これらのプローブは、DNA二重鎖中の標的配列とハイブリダイズする。
放射性元素や蛍光で標識されたプローブは、様々な種類のハイブリダイゼーション反応にも使用される。
図1に、PNAプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの様子を示す。
PNAプローブはテロメアの長さを決定するために使用される。
ハイブリダイゼーションの際、プローブは一本鎖DNAと相補的に結合する。
プライマーとは
プライマーとは、DNA合成の起点となるDNAまたはRNAの短い鎖のことである。
RNAプライマーは、細胞内でDNAポリメラーゼの助けを借りてDNAの複製を開始させるために使用される。
合成DNAプライマーは、目的のDNA断片を増幅するために、主にPCRで使用される。
標的配列はフォワードプライマーとリバースプライマーと呼ばれる2つのプライマーで挟まれる。
プライマーを設計する際には、特異性と相補性が重要な要素です。
また、二次構造も避けなければならない。
以下に、プライマー設計の際に考慮すべきその他の要因について述べる。
- 溶融温度(Tm) – フォワード、リバースプライマーともに60〜64℃が最適な溶融温度です。
- アニーリング温度 – 実験のアニーリング温度は、各プライマーの融解温度より5 ℃低い温度とする。
- GC content – プライマーのGC contentは35-65%であることが望ましい。
フォワードプライマーとリバースプライマーがターゲットDNAの2本鎖にアニーリングする様子を図2に示す。
図2：プライマーアニーリング
DNAシークエンスでは、標的DNAを増幅する際にプライマーを使用する。
プライマーは、放射性元素や蛍光で標識され、様々な検出が可能である。
プローブとプライマーの類似性
- プローブとプライマーは、一本鎖のオリゴヌクレオチドで、相補的なDNAと結合するために、様々なPCR技術で使用されます。
- プローブ、プライマーともに、特定のDNA断片に特異的です。
- プローブ、プライマーともに、DNA/RNAのいずれでもよい。
- プローブ、プライマーともに、標的配列とアニールするための特定の温度を持っています。
- プローブ、プライマーともに、検出のために蛍光体を絡ませることができる。
プローブとプライマーの違い
定義
プローブ。
プローブは、サンプル内の特定の DNA 断片の存在を検出するために使用される DNA または RNA の断片です。
プライマー：プライマーとは、DNA合成の起点となるDNAまたはRNAの短鎖のことである。
役割
プローブのこと。
プローブ：qPCR において、特定の DNA 断片を検出するために使用される。
プライマー：プライマーは、DNAの複製を開始させるために使用されます。
また、PCRを開始する際にも使用される。
長さ
プローブのこと。
プローブの長さは、25-1000塩基対の範囲です。
プライマー：プライマーの長さは18-22塩基対の範囲です。
ハイブリッド化
プローブを使用します。
プローブ：2本鎖DNAとハイブリダイズする。
プライマー：プライマーは一本鎖DNAとハイブリダイズする。
ラベリング
プローブのこと。
プローブは一般に検出のための蛍光色素で標識されている。
プライマー：プライマーは目的に応じて標識することができます。
結論
プローブとプライマーは、様々な種類の PCR で使用される一本鎖オリゴヌクレオチドの二種です。
プローブは、qPCR において特定の DNA 断片を検出するために使用される。
プライマーは細胞内でDNAの複製を開始させるために使用され、PCRの開始にも使用される。
従って、プローブとプライマーの主な違いはその目的です。
