バクテリアは、地球上で最も普遍的な生命体です。
細菌のバイオマスは、植物や動物のそれを上回っている。
その豊富さゆえに、これまでほとんどの細菌種が同定されていない。
従来の細菌の同定は、表現型の特徴に基づくもので、遺伝子型の方法と比べると正確性に欠ける。
16S rRNA配列の比較は、細菌を属レベルで同定するための最も好ましい遺伝子型判定法として浮上している。
16S rRNA をハウスキーピング遺伝子として使用する理由はいくつかありますが、その詳細について説明します。
16S rRNAとは
16S rRNAは原核生物のリボソームの小サブユニットの構成要素です。
原核生物のリボソームには、50S大サブユニットと30S小サブユニットの2つのサブユニットがあります。
これらは70Sリボソームを形成している。
小サブユニットは、16S rRNAが21個のタンパク質と結合したものです。
16S rRNAは1540個のヌクレオチドから構成されている。
図1に16S rRNAの二次構造を示す。
図1: 16S rRNAの二次構造
16S rRNAの3’末端には、開始コドンAUGの上流に結合するアンチシャイン-ダルガーノ配列が存在する。
Shine-Dalgarno配列は、バクテリアのmRNAのリボソーム結合部位です。
16S rRNAは細菌の機能に必須であるため、16S rRNAをコードする遺伝子は細菌種間で高度に保存されている。
16S rRNAの配列は、細菌の同定や分類に広く利用されている。
なぜ16S rRNAで細菌を特定するのか？
従来のバクテリアの同定方法は、主にバクテリアの表現型特性に基づいていました。
しかし、16S rRNA 配列の比較は「ゴールドスタンダード」となり、従来の細菌同定方法に取って代わりました。
16S rRNA配列の解析は、表現型が異常な株、記載が不十分な株、めったに分離されない株の同定に優れています。
また、非培養菌や新規病原体の同定にも適しています。
16S rRNA 遺伝子は、細菌ゲノムの rRNA オペロンに存在する。
図2にrRNAオペロンを示す。
図2: rRNA オペロン
16S rRNAがハウスキーピングマーカーとして適している理由はいくつかあります。
以下に、その理由を説明します。
- 16S rRNA 遺伝子は、細菌ゲノム中に遍在している遺伝子です。16S rRNA 遺伝子は、バクテリアのゲノム中に存在するユビキタスな遺伝子であり、その機能はバクテリアの翻訳時に必須であるため、ほとんどのバクテリアのゲノムが 16S rRNA 遺伝子で構成されています。
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- 16S rRNA遺伝子の配列は高度に保存されている。16S rRNAの機能はより一般的であるため、16S rRNA遺伝子の配列は高度に保存されている。遺伝子配列の変化は、時間（進化）の測定と考えることができる。
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- 16S rRNA 遺伝子の大きさ（1, 550 bp）は、バイオインフォマティクス上、十分な大きさです。
- 16S rRNA遺伝子は、細菌ゲノムの中でよく研究されている遺伝子です。16S rRNA遺伝子の機能は、細胞にとって重要であるため、多くの研究が行われている。
識別番号
現在までに、8,168種以上の細菌が16S rRNA遺伝子配列を用いて同定されています。
以下に、同定作業の手順を示す。
- ゲノムDNAの抽出
- 16S rRNA遺伝子のPCR増幅
- 増幅した 16S rRNA 遺伝子の塩基配列の取得 4.
- データベース中の既存の塩基配列と比較する。
16S rRNAの塩基配列は約1,550塩基対の長さで、可変領域と保存領域から構成されています。
保存領域と相補的なユニバーサルプライマーを用いることで、PCRによる可変領域の増幅が可能である。
一般的には、遺伝子の先頭から540塩基対の領域または遺伝子全体がPCRで増幅される。
PCR断片の塩基配列を決定し、既存の16S rRNA遺伝子の塩基配列と比較することで、分離前の菌種を同定することができる。
塩基配列の最大の保存場所であるGenBankには、9万種の16S rRNA遺伝子の2,000万を超える塩基配列が登録されている。
新規の細菌種であれば、データベース内のどの16S rRNA配列とも一致しない。
分類
16S rRNA 遺伝子の配列は、ほぼ全ての細菌種に存在するため、異なる 16S rRNA 遺伝子の配列を比較することで、細菌を種や亜種のレベルまで区別することができます。
類似した細菌種は、16S rRNA遺伝子の配列が類似している可能性がある。
図3は、16S rRNA遺伝子配列の比較によって構築された細菌の系統樹です。
図3：16S rRNAの塩基配列比較から構築した系統樹
16S rRNAの微生物学への応用とは？
16S rRNA の微生物学への応用を以下に示します。
- 16S rRNA 遺伝子配列は、細菌種の同定および分類のための「ゴールドスタンダード」として使用されている。
- 16S rRNA 配列の比較は、新規病原体の認識に用いることができる。
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- 16S rRNA シークエンスは、医療微生物学における細菌同定の表現型法に代わる、迅速かつ安価な方法として利用できる。
結論
16S rRNAは、細菌のmRNAが翻訳される際にリボソームと結合する場所を提供するため、細菌の機能にとって不可欠です。
16S rRNAの機能は細胞にとって必須であるため、その遺伝子配列はほぼ全ての細菌細胞に存在する。
また、その配列は高度に保存されている。
しかし、16S rRNAの配列は可変領域からも構成されており、細菌種を識別することが可能です。
また、16S rRNA の遺伝子配列に基づいて細菌種を分類することができる。
