オリゴdTとキャリアの組み合わせは、主にアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる手法でtotal RNAからmRNAを精製する際に使用されます。
細胞の種類によってtotal RNAからmRNAを分離する方法は大きく分けて2つあり、ダイレクト法によるmRNAの分離とマイナス法によるmRNAの分離があります。
今回は、この2つの方法について説明します。
メッセンジャーRNA（mRNA）は、RNAのヌクレオチドが連なってできた転写産物です。
遺伝子の情報を核から細胞質へ運び、タンパク質の合成に利用されます。
特定の細胞株からRNAを分離すると、mRNAとともにrRNAとtRNAからなるtotal RNAが得られます。
したがって、細胞株のトランスクリプトームを研究する際には、total RNA の混合物から mRNA を分離する必要があります。
この分離には、mRNA分子の3′末端にポリ（A）テールが存在するなどのmRNA特有の性質が利用される。
オリゴdT分子はポリ（A）テールと相補的であるため、total RNAの混合物からmRNAを分離することができる。
mRNAとは
mRNAは、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物です。
真核生物の核内で生成され、特定のタンパク質を生成するための情報を細胞質内に運ぶ。
リボソームの助けを借りて翻訳される過程で、タンパク質のアミノ酸配列に翻訳される。
真核生物の転写によって作られる一次転写産物はプレmRNAと呼ばれる。
図1: mRNAの構造
転写後の修飾により、5′キャップやポリ（A）テールなどの特徴を持つ成熟mRNA分子が生成される。
特定の生物の全mRNAはトランスクリプトームと呼ばれる。
Total RNAの組成はどのようなものか
RNAを分離した結果をtotal RNAと呼びます。
このRNAは、細胞が作り出す3種類の主要なRNAすべてで構成されています。
mRNA、tRNA、rRNA です。
tRNAとrRNAはいずれも翻訳を助ける。
真核生物のmRNAの大きさは0.5～20kbです。
トランスファーRNA（tRNA）は、翻訳中に対応するアミノ酸を運んでくる。
長さは76～90塩基対で、mRNA上の特定のコドンと相補的なアンチコドン領域から構成されている。
リボソームRNA（rRNA）は、リボソームの構成要素です。
ヒトのrRNAの中には、長さ5kbのものもあります。
全RNAの90%以上がtRNAとrRNAで構成されている。
全RNAのうちmRNAはわずか1〜5％です。
典型的な哺乳類細胞は、細胞あたり約50万個のmRNA分子で構成されていると考えられる。
特定の種類のmRNAの量は、細胞あたり15-20,000コピーになることがあります。
トータルRNAからmRNAを単離する方法
cDNA ライブラリーの構築、マイクロアレイ作製のためのサンプル調製、微発現遺伝子のノーザンブロット解析など、多くの分子生物学的手法には、高品質な mRNA が必要とされます。
Total RNA から mRNA を分離する方法には、細胞の種類によって大きく分けて、ダイレクト法による mRNA 分離と マイナス法による mRNA 分離の 2 種類があります。
mRNAの直接単離法
真核生物の全RNAから成熟mRNAを分離する原理は、ポリ（A）テールに相補的なオリゴdT（オリゴデオキシチミジレート）を用いて、ポリアデニル化したmRNAをアフィニティ選択／アフィニティクロマトグラフィーで分離するものです。
これは、他の2種類のRNAであるtRNAとrRNAにはポリ(A)テールが存在しないために可能なことである。
mRNAは、そのポリ(A)テールに30～200個のアデニンヌクレオチドが存在する。
トータルRNAからmRNAを分離する際には、オリゴdT/キャリアの組み合わせで充填したアフィニティーカラムが使用されます。
オリゴdTとキャリアの組み合わせは、セルロース結合オリゴdT、ビオチン化オリゴdTとストレプトアビジン結合磁気ビーズ、オリゴdT結合ポリスチレンラテックスビーズのいずれでも可能です。
RNAの酵素分解を防ぐため、すべての実験条件はRNaseフリーの状態であることが望ましい。
図2: アフィニティークロマトグラフィー
Total RNAを高塩濃度のバッファーに溶解し、65～70℃に短時間加熱してRNAの二次構造を破壊する必要があります。
RNAの単離条件は、市販のmRNA単離用キットによって異なります。
しかし、poly(A)-RNA や mRNA の調製は 3 つのステップで構成されています。
-
- キャリアに接続したオリゴ dT 分子に poly(A)-RNA をハイブリダイズさせる。
- 結合していないRNAの洗浄
- 低ストリンジェンシー条件下でのオリゴdTとキャリアの組み合わせからのポリ(A)RNAの溶出
mRNAの単離方法
オリゴdTを用いたmRNAの精製では、ポリ(A)テールを持つmRNAや成熟した真核生物のmRNAしか得ることができません。
そこで、ポリ(A)テールを持たないmRNAの精製には、マイナス法と呼ばれる別の方法を使用することができます。
この方法は、酵母や細菌のtotal RNAからmRNAを分離する際に用いることができます。
また、真核細胞から成熟mRNAと一緒に未熟型mRNAを単離する場合にも使用できます。
また、Total RNAからLarge ribosomal RNAを除去し、トランスクリプトームの濃縮を行います。
ThermoFisher Scientific 社の RiboMinusTM Transcriptome Isolation キットは、酵母や細菌の total RNA から mRNA を効率的に精製するために、3つのステップを使用します。
- rRNA配列特異的な5′ビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブとtotal RNAのハイブリダイゼーションを行う。
- ストレプトアビジンコートした磁気ビーズと一緒にrRNA/5′-ビオチン標識プローブ複合体を除去する。
- 不純物の精製とmRNAの溶出。
結論
Total RNA は、mRNA、rRNA、tRNA の 3 種類の RNA で構成されています。
特定の生物のトランスクリプトームを解析するためには、total RNA から mRNA を精製することが不可欠です。
精製の方法は、mRNAの種類によって異なります。
真核生物のmRNAは、ポリ（A）テールを含んでおり、オリゴdTを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができます。
未熟な真核生物のmRNAや酵母・細菌細胞のmRNAは、total RNAからlarge rRNAを枯渇させることにより単離することが可能です。
