DNA抽出とRNA抽出の主な違いは、DNA抽出のpHレベルがpH8であるのに対し、RNA抽出のpHレベルはpH4.7である点です。
DNAはpHが酸性になると変性して有機相に移動する傾向があります。
RNAはリボース糖に2′OHが存在するため、pHがアルカリ性になるとアルカリ性の加水分解を受ける。
DNA抽出とRNA抽出は、組織の細胞から核酸を分離・精製するための2つの手順です。
どちらも3つのステップで構成されています。
良質のDNAとRNAは、分子生物学、バイオテクノロジー、ゲノミクス、疫学実験において重要な役割を果たす。
主な対象分野
- DNA 抽出とは
– 定義、手順 - RNA抽出とは
– 定義、手順 - DNA抽出とRNA抽出の共通点
– 共通点の概要 - DNA抽出とRNA抽出の違いとは？
– 主な違いの比較
主要な用語 細胞溶解、タンパク質の変性、DNA 抽出、pH、沈殿、RNA 抽出
DNA抽出とは
DNA抽出とは、DNAを分離・精製することです。
DNAは、血液、凍結組織サンプル、パラフィン組織ブロックから分離することができます。
DNA抽出の3つのステップは、細胞溶解、DNAの単離、沈殿です。
細胞溶解では、細胞膜や核の膜などの細胞膜のバリアーが破れてDNAが露出する。
次に、サンプルに含まれる膜脂質を除去する。
最後に、プロテアーゼによるDNA関連タンパク質の除去、RNaseによるRNAの除去を行い、DNAを沈殿させる。
DNA抽出の基本プロトコール
以下に、DNA抽出の基本的なプロトコルを示します。
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細胞溶解バッファーで細胞膜を溶解する。
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洗浄剤、界面活性剤で脂質を分解する。
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プロテアーゼを加えてタンパク質を消化
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RNaseの添加によるRNAの消化
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- 濃縮塩添加による細胞残渣、消化タンパク質、脂質、RNAの分離と遠心分離
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氷冷したエタノールまたはイソプロパノールでDNAをエタノール沈殿させる。
酢酸ナトリウムのイオン強度を利用して沈殿を改善することができる。
沈殿した DNA は、最終的に溶液中に糸状に現れる。
：図2 抽出されたDNA
フェノール-クロロホルム抽出も、DNAとタンパク質を分離するために用いることができる。
ここでは、フェノールが試料中のタンパク質を変性させ、DNAは抽出の最後に水相に残る。
そして、有機相の中に、変性したタンパク質を見つけることができるのです。
DNAを抽出するもう一つの方法は、ミニカラム精製法です。
この場合、DNAのカラムへの結合は、バッファーのpHと塩濃度に依存する。
RNA抽出とは
RNA抽出とは、試料からRNAを精製する工程を指します。
従来のRNA抽出法は、グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法と呼ばれるものです。
グアニジニウムチオシアネートは、タンパク質を変性させる。
さらに、水分子の水素結合を破壊し、カオトロピック剤として機能する。
RNA抽出にはTri-reagentと呼ばれる特殊な試薬が使用されます。
これはグアニジニウムチオシアネート、フェノール、酢酸ナトリウムを含んでいる。
RNA抽出の基本ステップの目的は、DNA抽出のそれと同様です。
以下に、RNA抽出のプロトコルを示す。
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- 細胞の浸透圧を維持するために、氷冷したPBSで細胞を洗浄する。
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- 細胞を吸引し、Tri-reagentでサンプルをホモジナイズする。
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クロロホルムを添加し、振盪する。
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遠心分離により3層になることがあります。
上層は水層で、透明です。
中層または間相には、沈殿した DNA が含まれる。
下層は有機層で、ピンク色をしている。
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- 水層を取り除き、イソプロパノールを加える。遠心分離するとペレットができることがあります。
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ペレットを75%エタノールで洗浄する。
ペレットを風乾する。
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- ペレットを TE バッファーまたは水で溶解する。
RNAの抽出は、一般にpH7以下で行われる。
pHがアルカリ性の場合、リボース糖の2′位にOH基が存在するため、RNAはアルカリ加水分解で分解されやすくなる。
また、RNAは酸性pHでは水相に留まる傾向があります。
一方、DNAは酸性pHでは変性して有機相に移動する傾向があります。
DNAはデオキシリボース糖でできており、アルカリによる加水分解を受けないため、DNAの抽出はpH8程度で行うことができます。
DNAとRNA抽出の類似点
- DNA抽出とRNA抽出は、生体試料から核酸を分離・精製するための手順です。
- 両者とも、細胞の溶解、残渣や関連タンパク質からの核酸の精製、抽出液の調製が必要です。
- 両手順とも、終始冷状態を維持する必要があります。
- 混合物中の成分の分離に遠心分離を伴う。
- 両手順とも、ヌクレアーゼ酵素の活性を不活性化させる必要があります。
- フェノール・クロロホルム抽出は、両抽出法とも重要な工程の一つです。
- グアニジニウムチオシアネートは、核酸の保護に使用することができる。
- RNAの沈殿は、イソプロパノールで行うことができます。
- 酢酸ナトリウムのイオン強度を利用し、核酸の沈殿を改善することができます。
- サンプルは260 nmでODを測定することにより定量することができます。
DNAとRNAの抽出の違い
定義
DNAの抽出。
RNA抽出。
抽出された核酸の種類
DNAの抽出。
RNA抽出。
pH
DNAの抽出。
RNA抽出。
ステップ数
DNAを抽出する。
細胞膜を破り、または細胞溶解して膜脂質を除去し、DNAを沈殿させる。
RNA抽出。
DEPC処理水の使用について
DNAの抽出 なし
RNA抽出。
ストレージ
DNA抽出。
RNA抽出。
長期保存について
DNA 抽出。
RNA抽出。
結論
DNAの抽出はpH8で行う。
DNAは酸性で変性するため、有機相に移動する傾向があります。
しかし、RNAの抽出は、アルカリ加水分解による劣化を防ぐため、低いpHで行われる。
DNA抽出もRNA抽出も、各ステップの基本的な目的は同じです。
DNA抽出とRNA抽出の主な違いは、それぞれの抽出で使用するpH条件です。
