サンガーシーケンスと次世代シーケンサーの主な違いは、サンガーシーケンスが一度に単一のDNA断片のみを処理するのに対し、次世代シーケンサーは一度に数百万個の断片を同時に処理することである。
さらに、サンガーシーケンスはアナログであるのに対し、次世代シーケンサーはデジタルであるため、ディープシーケンスによる新規または希少なバリアントの検出が可能である。
さらに、サンガーシーケンスは、一般的に20件までの少ないターゲット数に対して高速でコスト効率の良い方法であるのに対し、次世代シーケンサーは時間がかかり、コスト効率の悪い方法であることが特徴です。
サンガーシークエンシングと次世代シークエンシングは、DNA断片の塩基配列を決定する2つの方法です。
さらに、サンガーシーケンスと次世代シーケンサーの選択は、両手法の利点と限界に依存する。
主な対象分野
- サンガーシークエンスとは
– 定義、プロセス、重要性 - 次世代シーケンサーとは
– 定義、プロセス、重要性 - サンガーと次世代シーケンシングの共通点
– 共通点の概要 - サンガーと次世代シーケンサーの違いについて
– 主な違いの比較
この記事の重要な単語
次世代シーケンサー（NGS）、パラレルシーケンサー、サンガーシーケンサー（SGS）、シーケンス、シーケンスデプス
サンガーシークエンスとは
Sanger Sequencing (SGS) は、1977年にFredric Sangerによって開発された第一世代の配列決定法です。
In vitroのDNA複製の際に、DNAポリメラーゼが鎖終結ジデオキシヌクレオチドを選択的に取り込むことを利用する。
その後、生成されたアンプリコンをキャピラリー電気泳動で分離する。
一般に、サンガーシーケンスは、アンプリコンが100個以下の小規模なプロジェクトにおいて、迅速かつ費用対効果の高いシーケンシング手法として利用されています。
また、単一遺伝子のシーケンスに適している。
図1: サンガーシークエンス
さらに、サンガーシークエンスは、サンプル中のすべてのDNA断片からのシグナルを組み合わせて1つの配列を生成するアナログな手法です。
このため、個々のシグナルを分離することができない。
そのため、得られる信号は混合信号となり、サンプル中に25%以下の頻度で存在する変異体を同定することはできない。
次世代シーケンサーとは？
Next Generation Sequencing (NGS) は、第二世代のシーケンシング法です。
また、超並列処理の概念を持つハイスループットなDNAシーケンス手法です。
現在、次世代シーケンサーとして、Genome Analyzer/HiSeq/MiSeq (Illumina Solexa), SOLiD System (Thermo Fisher Scientific), Ion PGM/Ion Proton (Thermo Fisher Scientific), HeliScope Sequencer (Helicos BioSciences) などが使われている。
一般に、1回の装置運転で100万から430億のショートリード（各50-400塩基）のシーケンスが可能である。
図2：イルミナシーケンスにおけるクローン増幅の様子
さらに、次世代シーケンサーの最大の特徴は、複数の標的を並行して調査できることです。
これにより、変異の検出のスピードと効率が向上しました。
一般に、体細胞癌の変異では、腫瘍は正常細胞だけでなく癌細胞も含む不均一なものです。
しかし、次世代シーケンサーでクローン増幅によるDNAライブラリーを作成し、パラレルシーケンスを行うことで、ライブラリー中の各ターゲットDNA分子に由来するシグナルを物理的に分離することができる。
そのため、がん細胞のDNA配列と正常細胞のDNA配列を分離することができる。
全体として、次世代シーケンサーは、カバレッジバリアントの深さをより高めたデジタルシーケンサーであると言えます。
サンガーと次世代シーケンサーの共通点
- DNA断片の塩基配列を決定する方法として、サンガー法と次世代シーケンシング法があります。
- 両者の技術は類似しており、DNAポリメラーゼによって成長する鋳型鎖に蛍光性のヌクレオチドを付加するものです。
- また、添加されたヌクレオチドの識別は、蛍光タグによって行われます。
- また、どちらも自動化された技術です。
サンガーと次世代シーケンサーの違い
定義
サンガーシーケンスとは、個人のゲノムの塩基配列の一部を決定する低スループットな手法であり、次世代シーケンスとは、個人のゲノムの塩基配列の一部を決定する高スループットな手法のことである。
したがって、これがサンガーと次世代シーケンサーの大きな違いです。
その他の名称
Sanger sequencingの別名は、dideoxy chain termination methodまたはcapillary electrophoresis sequencing、次世代シーケンサーの別名は、massive parallel sequencingまたはmassively parallel sequencingです。
世代
サンガーシーケンスは第一世代、次世代シーケンスは第二世代の配列決定法です。
商品化
また、Sanger sequencingはApplied Biosystems社が最初に商業化したものであり、次世代シーケンサーのプラットフォームはIllumina社が主流となっている。
DNA断片の大きさ
サンガーと次世代シーケンサーのもう一つの違いは、サンガーのシーケンサーが750-1000塩基対の断片に適しているのに対し、次世代シーケンサーは約2000万塩基対の長さの断片に適している点です。
一度に採取するサンプル数
さらに、サンガーシーケンスは一度に一つのDNA断片しか処理できないのに対し、次世代シーケンサーは一度に数百万の断片を同時に処理することが可能です。
カバレッジの深さ
重要なことは、サンガーシークエンスは混合物中のすべてのDNA断片を結合して一つの配列を生成するアナログ的なものであるのに対し、次世代シークエンスは混合物中の単一分子からの個々のデータを分離することができるデジタル的なものであることである。
感度
また、感度もサンガーと次世代シーケンサーの違いの一つです。
サンガーシーケンスは検出限界が15～20％程度と感度が低く、次世代シーケンサーは検出限界1％以下と感度が高い。
低サンプル数あたりのコスト
また、Sanger sequencingは20サンプルまでなら高速で費用対効果が高いのですが、次世代シーケンサーは20サンプルまでだと時間がかかり費用対効果も低くなります。
より多くのサンプル数に対するコスト
サンガーシーケンスはサンプル数が多いほど費用対効果が悪く、次世代シーケンスはサンプル数が多いほど費用対効果が良くなります。
クリニカル・リサーチ・シークエンス
サンガーと次世代シーケンサーのもう一つの違いは、サンガーシーケンサーが臨床研究用シーケンサーの「ゴールドスタンダード」であるのに対し、次世代シーケンサーは臨床ラボで一般的になりつつあることである。
アプリケーション
また、サンガーシーケンスはフラグメント解析、微生物同定、STR解析、NGS確認などに、次世代シーケンサーは病原性微生物ゲノムを含むゲノム解読、トランスクリプトーム解析、変異検出などに重要な役割を担っています。
結論
サンガーシークエンスは、蛍光標識したジデオキシヌクレオチドで標的DNA断片を増幅し、キャピラリー電気泳動で解析する第一世代のシークエンス手法です。
一般に、この方法は少量のサンプルで迅速かつ費用対効果の高い方法です。
アナログ的な方法であるため、感度は低い。
一方、次世代シーケンサーは、サンガーシーケンサーと同様の技術を用いた第二世代のシーケンサーです。
数百万サンプルを一度に処理する超並列シーケンシング法です。
さらに、次世代シーケンサーの最大の特徴は、バリアントの検出を可能にするシーケンシングデプスにあります。
したがって、サンガーと次世代シーケンサーの主な違いは、処理するサンプル数とシーケンスの深さです。
