エンドスポアー染色に熱が使われる理由

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エンドスポアの染色には、差分染色法が用いられる。

マラカイトグリーンを一次染色とし、サンプル内の植物細胞とエンドスポアの両方を染色する。

その後、熱を加えることにより、一次染色を胞子まで浸透させる。

脱色後、カウンターステインのサフラニンを用いて背景を染色する。

バチルス属とクロストリジウム属という2つの病原体は、悪環境に耐えるために代謝的に不活性な内胞子を産生する。

エンドスポアは多くの致死的疾患の原因となるため、臨床検体においてその同定は非常に重要です。

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エンドスポアーズとは

内胞子は、バチルスやクロストリジウムなどの一部の病原性細菌が、不利な環境条件下で生き残るために作り出す抵抗性の構造体です。

その条件とは、熱、乾燥、放射線、化学物質などです。

植物細胞から内生胞子が作られる過程を胞子形成という。

この過程が完了するまでに8〜10時間かかることがあります。

内胞子は、細菌細胞内に存在する場合と、遊離胞子として存在する場合があります。

図1に内胞子形成の様子を示す。

Why is Heat Used in Endospore Staining_Figure 1:図1 内胞子形成の様子

内胞子は、代謝的に不活性または休眠状態です。

細胞質は少量で、DNAは外側の保護膜に覆われている。

細胞壁はジピコリン酸からなり、内胞子に耐熱性を与えている。

環境条件が整うと発芽し、新たな生物を生み出す。

121℃、15分の湿熱処理により、細菌の内胞子は破壊されることがあります。

エンドスポアスタイリングとは

内胞子染色は、試料の異なる構造を異なる色で染色する差延染色法です。

これにより、植物細胞から胞子を識別することができる。

標準的な胞子染めのプロセスは、Schaeffer-Dulton法です。

この手法の主染色はマラカイトグリーンで、対染色はサフラニンです。

シェーファー・ドゥルトン・テクニック – 手順

    1. 顕微鏡用スライドに塗抹した後、マラカイトグリーン溶液で細菌試料を飽和させる。
    1. その後、染料が蒸発し始めるまで、スライドを3~5分間軽く加熱する。
    1. スライドを冷却し、脱色のために水で洗浄する。
    1. 最後に、カウンターステイン後、スライドをリンスする。
    1. スライドを風乾させ、顕微鏡で観察する。

ここでは、内胞子はマラカイトグリーンで緑色に、植物細胞はサフラニンでピンク色に染色されている。

図2にSchaeffer-Dulton法による内生胞子の染色を示す。

Why is Heat Used in Endospore Staining_Figure 2:図2 内胞子(緑色)と植物細胞(ピンク色)

胞子染色の別の方法として、Donerの方法があります。

この方法では、内生胞子は赤色に染色される。

エンドスポアーの染色に熱が使われる理由

エンドスポアのケラチンは染色に耐えられる。

そのため、主染料を胞子内に押し込まなければならない。

熱を加えることで、主染料が胞子内に浸透しやすくなる。

マラカイトグリーンを塗布したスライドは、3〜5分まで加熱できる。

加熱時間は、エンドスポアーの壁に浸透した色素の量に正比例する。

加熱時間が長いと、エンドスポアーの壁に孔ができ、より多くの染料が浸透しやすくなる。

結論

内生胞子は、ほとんどの病原性細菌の生殖細胞です。

そのため、検体中の内胞子を同定することは、診断上非常に重要です。

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