PCRプライマーとシーケンシングプライマーの違いとは?分かりやすく解説!

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PCRプライマーとシーケンシングプライマーの大きな違いは、PCRプライマーはPCRで増幅してアンプリコンを得るために重要であるのに対し、シーケンシングプライマーはDNA断片の塩基配列を明らかにするために重要であることである

さらに、PCRではフォワードプライマーとリバースプライマーの2つのプライマーを用いるが、シークエンスではシークエンスプライマー1つで十分です。

また、PCRのプライマーは増幅したい塩基配列に特異的であるが、シーケンシングのプライマーは必ずしも標的の塩基配列に関連するとは限らない。

PCRプライマーとシーケンシングプライマーは、2種類の短いオリゴヌクレオチド配列で、in vitroでのDNA合成の開始を補助する役割を担っている。

主な対象分野

  1. PCRプライマーとは
         – 定義、特徴、機能
  2. 塩基配列決定用プライマーとは
         – 定義、特徴、機能
  3. PCRプライマーとシーケンシングプライマーとの共通点
         – 共通する特徴の概要
  4. PCRプライマーとシーケンシングプライマーの違いについて
         – 主な違いの比較

この記事の重要な単語

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PCRプライマーとは

PCRプライマーとは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と呼ばれるプロセスにおいて、DNA合成をin vitroで開始させる役割を持つ短いDNA配列のことである

一般に、DNAの合成にはDNAポリメラーゼが関与している。

しかし、DNAの複製を開始するためには、3′OH末端が必要である

そこで、DNAの複製開始点に短いRNAプライマーをin vivoで合成する酵素が、RNAプライマーゼです。

一方、PCRでDNAを合成する際には、DNAプライマーを使用する(in vitro)。

タイプ

さらに、あるPCR反応に使用されるプライマーには2つの種類があります。

それはフォワードプライマーとリバースプライマーです。

一般に、フォワードプライマーは二本鎖DNAのアンチセンス鎖にアニーリングする。

これに対して、リバースプライマーはセンス鎖にアニールする。

一般に、アンチセンス鎖は3′から5′方向へ、センス鎖は5′から3′方向へ伸びる。

ただし、フォワードプライマーとリバースプライマーは、増幅される標的DNA配列を挟んでいる。

プライマー設計

PCRプライマーの設計は、標的DNA配列を増幅するPCR反応を成功させるために重要なステップです。

基本的にPCRプライマーの長さは18-22塩基であるべきです。

また、GC含量は50-55%であることが望ましい。

さらに、プライマーは3′末端にGCロックがあることが望ましい。

さらに、プライマーの溶融温度は50〜55℃であることが望ましい。

また、プライマーには、多塩基領域、二次構造、プライマーダイマー形成が起こってはならない。

シーケンシングプライマーとは

シーケンシングプライマーとは、シーケンシング反応を開始させるためのプライマーです。

一般に、サンガーシーケンスや次世代DNAシーケンスでは、プライマーを必要とします

例えば、DNA1分子につき2本の相補的なDNA鎖が存在する。

そのため、1つのDNA断片に対して、センス配列とアンチセンス配列の2つの配列が存在することになります。

しかし、塩基配列決定反応では、1本のDNA鎖の塩基配列のみが決定される。

従って、塩基配列決定反応に使用するプライマーは1種類のみです。

ただし、このプライマーは、フォワードプライマーであってもリバースプライマーであってもよい。

図2:サンガーシークエンシングにおけるプライマーの役割

また、フォワードプライマーとリバースプライマーを使い分けることで、2回のシーケンス反応でDNA断片の両鎖をシーケンスすることも可能である

また、シーケンシングプライマーは、フォワードプライマーやリバースプライマーのように標的DNA配列の周囲を囲む必要はない

つまり、シーケンシングプライマーは、ベクターバックボーンに含まれる配列にもアニールすることができる。

シーケンシング用ベクターバックボーン上のユニバーサルプライマーの例としては、T7、SP6、M13リバース、CMVフォワードなどがあります。

PCRプライマーとシーケンシングプライマーの類似性

  • PCRプライマーとシーケンシングプライマーは、2種類のプライマーです。
  • どちらも短いオリゴヌクレオチド配列です。
  • DNAの相補的な配列に結合することで、in vitroでDNA合成を開始させる役割を担っている。

PCRプライマーとシーケンシングプライマーの違いについて

定義

PCRプライマーはPCR反応に使用される一本鎖DNAの短い断片を指し、シーケンシングプライマーはシーケンシング反応においてDNA合成を開始するために使用される短いヌクレオチド配列を指します。

主な目的

PCRプライマーは、PCR増幅でアンプリコンを得るために使用し、シーケンシングプライマーは、DNA断片の塩基配列を明らかにするために使用します。

タイプ

PCRではフォワードプライマーとリバースプライマーの2種類のプライマーを使用し、シーケンシングではシーケンシングプライマー1種類を使用します。

特異性

PCRプライマーは増幅される塩基配列に特異的であるが、シーケンシングプライマーは標的DNA配列に必ずしも関連性がない。

制限部位

PCRプライマーは制限部位を含むことがありますが、シーケンシングプライマーは制限部位を持ちません。

縮退

PCRプライマーはdegenerateなプライマーになり得るが、シークエンスプライマーはdegenerateではない。

結論

PCRプライマーとは、目的とするDNA配列を増幅するためのPCR反応に用いる2種類のプライマーのことである

また、PCRプライマーにはフォワードプライマーとリバースプライマーの2種類があります。

重要なのは、この2種類のプライマーが標的DNA配列を挟むことで、各DNA鎖の合成が開始されやすくなることである

一方、シーケンシングプライマーは、シーケンシング反応において、相補的なDNA鎖の合成を開始させるのに役立つプライマーです。

しかし、シーケンシング反応では1つのプライマーしか使用されない。

したがって、PCRプライマーとシーケンシングプライマーの主な違いは、その目的と用途にある。

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