安定した形質転換細胞株の作り方

安定的なトランスフェクションとは、外来DNAを細胞内に長期的に導入することである。

安定にトランスフェクションされた細胞は、外来DNAを子孫に受け継がせる。

したがって、安定的にトランスフェクションされた細胞株を作るには、外来DNAが細胞株のゲノムに組み込まれる必要がある。

しかし、非ゲノムDNAでも安定した遺伝が観察されることがあります。

安定したトランスフェクションを成功させるためには、DNAの効果的な導入方法と、細胞株内の外来DNAの選択方法が必要である。

安定的にトランスフェクションされた細胞株は、組換えタンパク質の生産、遺伝子機能研究、創薬アッセイなど、幅広い用途に使用されている。

安定したトランスフェクション細胞株の作り方

トランスフェクションとは、化学的あるいは非化学的手法により、宿主細胞に意図的に遺伝物質を導入する遺伝子導入法です。

安定的に導入された細胞株には2種類あります。

安定な細胞株の主なタイプは、トランスフェクトされたDNAが宿主生物のゲノムに直接組み込まれることによって作製されるものです。トランスフェクションされたDNAは、相同組換えによりゲノムに組み込まれる。
もう一つの安定な細胞株の作製法は、導入したDNAをエピソームで維持する方法です。真核生物ベクターは、ゲノムに組み込まれないDNAのトランスフェクションに使用される。しかし、エピソームDNAの安定性は低い。また、エピソームはある種の生物種によってのみ維持される。図1に安定にトランスフェクションされた細胞株を示す。

図1: エピソームを安定に導入した細胞株

安定した細胞株を作製するための手順を以下に示す。

最適な選択抗生物質濃度を決定するキルカーブの作成 – 細胞に抗生物質濃度を増加させ、1週間かけてすべての細胞を殺すために必要な最小抗生物質濃度を決定する。
1. 目的のプラスミドを細胞にトランスフェクションする – トランスフェクションの方法は、宿主細胞の種類によって異なる。付着細胞へのトランスフェクションには、リポソーム試薬が使用される。浮遊細胞へのトランスフェクションには、エレクトロトランスフェクションやウイルス法が使用される。
1. 安定ポリクローンコロニーの選択と増殖 – トランスフェクション後48～72時間目に、高濃度、最適濃度、低濃度の選択的抗生物質を培養物に添加し、安定にトランスフェクトされた細胞株を取得する。

選択マーカーは、トランスフェクションに成功した細胞を選択するために、トランスフェクションされたDNAと一緒に発現される。

マーカー遺伝子は、宿主細胞へのトランスフェクションに使用したベクターと同じもの（cis）でも、別のベクター上（trans）でもよい。

選択には、ネオマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、DHFRなどの抗生物質に対する耐性を利用することができる。

また、トランスフェクトした遺伝子にはGFPのタグを付けることができます。

安定な細胞株は、主に遺伝子導入したDNAをゲノムに組み込むことによって作ることができる。

また、宿主生物によっては、導入したDNAをエピソームで維持することで、長期間安定な細胞株を作ることができる。

細胞株中の導入DNAを同定するための選択方法があることが望ましい。