プライマーは、in vivoとin vitroの両方でDNAの増幅に不可欠な要素です。
生体内では、DNAポリメラーゼという酵素がDNAの複製を開始するためにプライマーを必要とします。
In vitroでは、プライマーは主にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の開始に使用されます。
配列決定、クローニング、部位特異的変異導入など、他の技術でもプライマーを必要とするものがある。
したがって、in vitro技術に用いるプライマーの設計は、分子生物学者にとっては非常に簡単ではあるが、困難な作業です。
そこで、本稿ではPCRとシーケンシングのプライマー設計の基本的なルールについて解説する。
プライマーとは
プライマーとは、DNA合成の起点となるDNAまたはRNAの短い鎖のことである。
DNAの複製を触媒する酵素は、既存の3′末端にヌクレオチドを付加することができる。
したがって、プライマーは、プライムの役割を果たすことによって、DNA合成の基礎を築く。
RNAプライマーは、細胞内でDNAポリメラーゼによるDNA複製の開始のために使用される。
しかし、合成DNAプライマーは、主にPCRなどによるDNAの増幅に用いることができる。
PCRでは2種類のプライマーが使用され、それらはフォワードプライマーとリバースプライマーと呼ばれる。
PCRの際、ゲノムDNA中のその特定のDNA配列をフォワードプライマーとリバースプライマーで挟むことにより、目的のDNA断片を数百万コピー生産することができる。
図1に、ある特定のDNA配列を挟むフォワードプライマーとリバースプライマーを示す。
図1: フォワードプライマーとリバースプライマー
プライマーはPCRでどのように機能するか
DNAは2本の鎖が結合した分子です。
塩基対のパターンは、両方の鎖でそれぞれ相補的です。
2本の鎖は、相補的な窒素塩基間の水素結合によって結合されている。
また、それぞれの鎖は独自の方向性を持っています。
一方の鎖は5’から3′の方向性を持ち、他方の鎖は3′から5′の方向性を持っています。
従って、2本の鎖は反平行です。
5′-3′方向の鎖をセンス鎖、3′-5′方向の鎖をアンチセンス鎖と呼びます。
PCRでは2本の鎖をそれぞれ個別に合成する必要がある。
PCRの3つのステップは、変性、アニーリング、伸長です。
変性では、95 ℃に加熱して水素結合を切断し、2本のDNA鎖を分離する。
フォワードプライマーはセンス鎖に結合し、リバースプライマーはアンチセンス鎖に結合する。
95℃から50-60℃に温度が下がると、プライマーのアニーリングが起こる。
したがって、Taqポリメラーゼの助けを借りて、両方の鎖を同時に合成することができる。
センス鎖とアンチセンス鎖の増幅は5′から3′の方向で起こる。
PCRは指数関数的な反応であるため、3つのステップを25-35サイクルで繰り返す。
各サイクルではフォワードプライマーとリバースプライマーの両方が使用され、目的のDNA断片が約235コピー生成される。
PCRにおけるプライマーの役割を図2に示す。
図2：PCR
PCR用プライマーの作り方
ゲノム中のある特定のDNA断片を増幅するためには、その特定のDNA断片をフォワードプライマーとリバースプライマーで挟む必要がある。
従って、両方のプライマーはDNA断片を挟む配列に相補的でなければならない。
PCRプライマーをうまく設計するための基本的なガイドラインを以下に示す。
- フォワード、リバースプライマーの方向は5′から3′であること。
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- 各プライマーの長さは18から25ヌクレオチドの間であること。
- 3.プライマーのGC含量は40〜60％とし、3’末端にCまたはGがあると結合が促進される場合があります。
- 4.プライマーペアの融解温度とTm（プライマーの半分が鋳型にアニーリングした温度）は同等で、60℃以上であることが望ましい。その差は最大でも5 °Cであることが望ましい。
- プライマーの3′末端が鋳型DNAと完全に一致すること。
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- プライマーの3′末端の最後の5塩基に少なくとも2GまたはC塩基（GC clamp）が存在すること。GC clampは、標的配列との強い結合を促進する。
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- プライマーの5’末端には、5〜6塩基の制限部位を付加することができる。
- 8.プライマーにジヌクレオチドの繰り返し（ATATATAT）や同じヌクレオチドの4回以上の繰り返し（ACCCC）は避けなければならない。ミスプライミングの原因となります。
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- プライマー内の相同性、プライマーの二次構造は避ける。プライマー間の相同性、フォワードプライマーとリバースプライマーの相補配列は避けてください。いずれも自己二量体、プライマー二量体を形成する可能性があります。
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- 二量体解析のΔG値は、0〜-9 kcal/moleとする。
Primer 3、Primer X、NetPrimer、DNAstrarなど、プライマー設計を容易にするためのオンラインツールが多数提供されている。
また、設計したプライマーの特異性は、NCBI Primer-BLASTやUCSC in-silico PCRなどのツールを用いて決定することができる。
図3: Primer 3インターフェース
配列決定用プライマーの設計方法
シーケンシングプライマーはPCRプライマーと同じように短いDNA鎖です。
しかし、PCRプライマーが特定のDNA断片を増幅するために設計されているのに対し、シーケンシングプライマーはPCRによって増幅されたDNA断片の塩基配列を明らかにするために使用される。
PCRプライマーと異なり、シーケンシングでは、目的とする配列の長さが500bp以下であれば、1つのプライマーを用いることができる。
例えば、PCRのフォワードプライマーを用いて、センス鎖のみを増幅し、シークエンスすることができる。
また、シーケンシング反応時に許容されるミスマッチの程度は、PCRよりも高い。
一般に、PCRのプライマーは標的配列に相補的です。
しかし、シーケンシングプライマーの中には、標的配列と相補的でないものもあります。
これらはユニバーサルプライマーと呼ばれる。
T7やSP6のようなユニバーサルプライマーは、標的配列を運ぶベクターにアニールする。
様々なベクター、様々な種類のDNA断片に対応できる。
結論
プライマーはPCRやシークエンスにおいて、DNA合成を開始するために使用される。
PCRのプライマーにはフォワードプライマーとリバースプライマーの2種類があります。
フォワードプライマーはセンス鎖にアニーリングし、リバースプライマーはアンチセンス鎖にアニーリングする。
シーケンシングでは、フォワードプライマーとリバースプライマーのどちらを使っても標的を増幅することができる。
プライマーの設計では、プライマーの長さ、Tm、GC含量など多くの要因を考慮する必要がある。
プライマーの設計には、多くのオンラインツールが利用可能で、特定の配列に対応したプライマーを設計することができる。
