エンドスポアの染色には、差分染色法が用いられる。
マラカイトグリーンを一次染色とし、サンプル内の植物細胞とエンドスポアの両方を染色する。
その後、熱を加えることにより、一次染色を胞子まで浸透させる。
脱色後、カウンターステインのサフラニンを用いて背景を染色する。
バチルス属とクロストリジウム属という2つの病原体は、悪環境に耐えるために代謝的に不活性な内胞子を産生する。
エンドスポアは多くの致死的疾患の原因となるため、臨床検体においてその同定は非常に重要です。
エンドスポアーズとは
内胞子は、バチルスやクロストリジウムなどの一部の病原性細菌が、不利な環境条件下で生き残るために作り出す抵抗性の構造体です。
その条件とは、熱、乾燥、放射線、化学物質などです。
植物細胞から内生胞子が作られる過程を胞子形成という。
この過程が完了するまでに8〜10時間かかることがあります。
内胞子は、細菌細胞内に存在する場合と、遊離胞子として存在する場合があります。
図1に内胞子形成の様子を示す。
：図1 内胞子形成の様子
内胞子は、代謝的に不活性または休眠状態です。
細胞質は少量で、DNAは外側の保護膜に覆われている。
細胞壁はジピコリン酸からなり、内胞子に耐熱性を与えている。
環境条件が整うと発芽し、新たな生物を生み出す。
121℃、15分の湿熱処理により、細菌の内胞子は破壊されることがあります。
エンドスポアスタイリングとは
内胞子染色は、試料の異なる構造を異なる色で染色する差延染色法です。
これにより、植物細胞から胞子を識別することができる。
標準的な胞子染めのプロセスは、Schaeffer-Dulton法です。
この手法の主染色はマラカイトグリーンで、対染色はサフラニンです。
シェーファー・ドゥルトン・テクニック – 手順
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- 顕微鏡用スライドに塗抹した後、マラカイトグリーン溶液で細菌試料を飽和させる。
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- その後、染料が蒸発し始めるまで、スライドを3～5分間軽く加熱する。
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- スライドを冷却し、脱色のために水で洗浄する。
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- 最後に、カウンターステイン後、スライドをリンスする。
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- スライドを風乾させ、顕微鏡で観察する。
ここでは、内胞子はマラカイトグリーンで緑色に、植物細胞はサフラニンでピンク色に染色されている。
図2にSchaeffer-Dulton法による内生胞子の染色を示す。
：図2 内胞子（緑色）と植物細胞（ピンク色）
胞子染色の別の方法として、Donerの方法があります。
この方法では、内生胞子は赤色に染色される。
エンドスポアーの染色に熱が使われる理由
エンドスポアのケラチンは染色に耐えられる。
そのため、主染料を胞子内に押し込まなければならない。
熱を加えることで、主染料が胞子内に浸透しやすくなる。
マラカイトグリーンを塗布したスライドは、3〜5分まで加熱できる。
加熱時間は、エンドスポアーの壁に浸透した色素の量に正比例する。
加熱時間が長いと、エンドスポアーの壁に孔ができ、より多くの染料が浸透しやすくなる。
結論
内生胞子は、ほとんどの病原性細菌の生殖細胞です。
そのため、検体中の内胞子を同定することは、診断上非常に重要です。
