直接法と間接法の主な違いは、直接法では一次抗体と検出酵素が直接結合しているのに対し、間接法では一次抗体と相補的な二次抗体が検出酵素と結合していることです。
つまり、直接法では1つの抗体を使用し、間接法では2つの抗体を使用します。
直接法と間接法は、培地中の特定の抗原または抗体の存在を検出するために用いられるELISA（酵素結合免疫吸着測定法）の2つの方法です。
ダイレクトエリザイムとは
Direct ELISAとは、酵素結合一次抗体そのもので抗原を検出することができるELISA法です。
このELISA法は、PerlmannとEngvallが最初に開発したものです。
ELISAの中で最もシンプルな形式とされています。
直接法 ELISA の手順を以下に示す。
- 1.プレート表面に試料を塗布する。
-
- 酵素標識一次抗体とインキュベートする。
-
- プレートから未結合の抗体を除去するための洗浄。
-
- 酵素反応に必要な基質を添加する。
- プレートから生成されるシグナルの検出。
ここで、一次抗体と結合する酵素は、主にHRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）とアルカリホスファターゼの2種類です。
また、HRPとともに用いられる基質は、OPD（o-phenylenediamine dihydrochloride）、TMB（3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine）、ABTS（2, 2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt）の3種が用いられる。
アルカリホスファターゼとともに用いられる基質は、PNPP（p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt）です。
基質に対する酵素反応により、基質の種類や反応に使用する酵素に応じた色の変化が培地に生じます。
これにより、標的抗原を持つサンプルの検出が容易になります。
直接法 ELISA は、試料中の高分子量抗原を検出するのに適しています。
このELISA法はステップ数が少ないため、より迅速なアッセイとなります。
しかし、一次抗体を酵素で標識するためのコストと時間がかかるため、直接法での使用は極めて稀です。
一方、標的抗原に悪影響を与えるという問題もあります。
間接法 ELISA とは
間接法とは、一次抗体と二次抗体の2つの抗体で検出するELISA法の一つです。
間接法 ELISA のステップは以下の通りです。
- プレート表面に試料を塗布する。
- 一次抗体とプレートをインキュベートする。
- プレートから未結合の抗体を除去するための洗浄。
-
- 検出酵素を結合させた二次抗体をプレートにインキュベートする。
-
- 洗浄により、プレートから結合していない抗体を除去する。
-
- 酵素反応に必要な基質を添加する。
-
- プレートから得られたシグナルの検出 図2: 間接法ELISA
間接法は、2つの抗体結合ステップを経て進行する。
一方、二次抗体は検出酵素と結合している。
一般に、二次抗体は酵素と結合したものが多く存在する。
ここで、二次抗体は、主にポリクローナル抗体、抗種抗体です。
酵素を結合させた抗体が利用できるため、寄生虫、細菌、ウイルスなどの検出における免疫学的測定では、間接法ELISAがより多く利用される。
一方、プレート中の一次抗体には、複数の二次抗体を結合させることができる。
そのため、アッセイの感度は非常に高い。
直接法と間接法の ELISA の類似点
- 直接法と間接法は、目的の抗原を直接プレートに付着させるELISA法です。
- 両法とも、検体中の特定のタンパク質分子の存在を検出する方法です。このタンパク質分子はプレートに直接付着させます。
- どちらの方法でも、96ウェルプレートまたは8ウェルストリップチューブが使用されます。いずれもポリスチレン製のプレートです。96-well プレートは、反応に最適な希釈倍率を決定するために十分なスペースがあります。一方、8-well ストリップチューブは、きめ細かなアッセイに適しています。
直接法と間接法のELISA法の違い
定義
一次抗体に検出酵素を結合させたものを直接免疫測定法、二次抗体に検出酵素を結合させたものを間接免疫測定法という。
使用した抗体の数
直接法では、一次抗体と二次抗体の2種類の抗体を使用しますが、間接法では、一次抗体と二次抗体の2種類の抗体 を使用します。
これが直接法と間接法の大きな違いです。
検出酵素のリンク先
また、直接法では検出酵素を一次抗体に結合させ、間接法では検出酵素を二次抗体に結合させます。
信号の強さ
直接法と間接法のもう一つの違いは、直接法では信号の強度が弱く、間接法では信号が増幅されるため強度が強くなることです。
バックグランドシグナル
しかし、直接法では間接法に比べ、より多くのバックグラウンドシグナルが発生します。
感度
直接法 ELISA は感度が低く、間接法 ELISA は感度が高い。
これも直接法と間接法の違いです。
クロスリアクタンス
直接法と間接法のもう一つの違いは、交差反応性です。
すなわち、交差反応性は直接法では最小であるが、間接法では顕著です。
時間
さらに、直接法 ELISA は工程数が少ないため時間がかからず、間接法 ELISA は抗体結合の工程が2回あるため時間がかかる。
使用頻度
直接法 ELISA は比較的まれであるが、間接法 ELISA はより一般的です。
結論
直接法 ELISA は、特定の抗原を検出するために一次抗体のみを使用します。
つまり、直接法では一次抗体は検出酵素と結合しています。
しかし、間接法では、一次抗体が抗原と結合し、酵素を結合させた二次抗体が一次抗体と結合します。
直接法は、酵素標識一次抗体の入手が困難なため、一般的ではありません。
直接法と間接法の主な違いは、使用する抗体の数です。
